哈佛大学的研究人员更接近了解沙眼衣原体细菌如何利用宿主细胞的分子机制进行入侵。该团队采用基于荧光激活细胞分选(FACS)的CRISPR筛选来鉴定已知促进致病袭的三种主要候选基因。
专性细菌沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)是一种阴险的微生物，可导致人类性传播疾病衣原体(Chlamydia)。
感染是进行性的，未确诊的患者失明，盆腔炎和不育的风险增加。因此，对支持沙眼衣原体发病机制的分子事件- 特别是人类宿主特有的感染许可因子 -的发展理解为治疗学的发展提供了新的途径。
该研究以现有研究为基础，通过在人类细胞的全基因组筛选中使用一种遗传工具RNAi，重点关注候选宿主因子的鉴定。这些筛选基于功能丧失，其中编码因子的基因被减少或消除。自那以后，CRISPR / Cas9编辑技术的出现为进行全基因组功能丧失筛选提供了一种新的改进方法。
结果出人意料Park及其同事证实了之前的研究，该研究表明超过50%的候选基因是与硫酸乙酰肝素合成有关的基因，证明硫酸乙酰肝素在沙眼衣原体附着于宿主细胞中的作用。
该小组进一步描述了一位未经怀疑的候选人的角色;COPI - 一种蛋白质复合物，如下所述。以前的研究未能证明COPI在发病机制中的作用。
来自哈佛大学Waldor实验室的研究小组使用基于荧光激活细胞分选(FACS)的人类细胞的CRISPR筛选来鉴定能够导致细胞内沙眼衣原体入侵过程的宿主蛋白。
该团队用表达荧光标记的沙眼衣原体感染Cas9细胞的功能丧失库。选择荧光标记阴性的细胞，因为细菌侵入细胞，遮蔽荧光。推测这些细胞富集候选基因，因为入侵是由宿主因子介导的。对这些细胞的sgRNA进行测序并分析其统计学显着性，产生17种可能的候选基因。
负责这些因素的主要基因分为三大类：细胞表面糖胺聚糖硫酸乙酰肝素的生物合成酶。硫酸乙酰肝素作为分子手柄，作为病原体的受体。肌动蛋白重塑的诱导剂，促进沙眼衣原体入侵。
外壳蛋白复合物I(COPI)，其有助于硫酸乙酰肝素生物合成和细胞表面呈递，沙眼衣原体的附着和其III型分泌系统(T3SS)的易位 - 能够将效应蛋白注射到宿主细胞中的装置。
COPI的鉴定值得注意;研究人员假设，先前研究中采用的方法可以防止罕见的亚型(那些具有导致部分基因功能丧失的突变)的COPI等位基因被鉴定出来。CRISPR的使用规避了这一点，提供了富集COPI等位基因的方法。
研究人员假设COPI介导的HS的合成和/或表面呈递通过间接机制发生，所述间接机制起作用以改变细胞的高尔基体和囊泡动力学。因此，推测HS依赖性病原体对COPI的侵袭具有共同依赖性。HS，虽然最高得分候选基因对于沙眼衣原体感染不是必需的，表明也存在独立于该蛋白多糖的途径。
该研究还证明了COPI在宿主细胞附着下游的作用。当研究人员使用急性破坏COPI的golgicide A时，他们发现TarP(一种通过肌动蛋白捆绑活动刺激沙眼衣原体T3SS的效应蛋白)的转运减少了。Park等。假设T3SS中的这种缺陷起因于膜脂组成的改变，这限制了其功能。
基于FACS的CRISPR筛查是一种有用的工具吗?研究人员得出结论，COPI在沙眼衣原体侵袭位置COPI作为一种有问题的治疗候选基因的背景下引发多重作用或其多效性的能力。这是因为难以确定与病原体入侵过程中的步骤的具体联系。因此，作者预测需要新的蛋白质扰动策略，以促进理解所有基因在病原体感染中的作用。
尽管如此，作者已经成功地证明了基于FACS的CRISPR筛选在鉴定导致致病性入侵的宿主因子的身份和机制作用方面的效用。用Park等人的话来说。“我们的研究结果再次证明了利用细胞内病原体作为探针来阐明宿主细胞生物学的实用性”。
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