我们生活在一个由 RNA 制造和运行的世界，RNA 是基因分子 DNA 的同等重要的兄弟姐妹。事实上，进化生物学家假设 RNA 甚至在 DNA 及其编码的蛋白质出现之前就存在并自我复制。快进到现代人类：科学表明，不到 3% 的人类基因组被转录成信使 RNA (mRNA) 分子，而信使 RNA (mRNA) 分子又被翻译成蛋白质。相比之下，其中 82% 被转录成具有其他功能的 RNA 分子，其中许多仍然是神秘的。
要了解单个 RNA 分子的作用，需要在其组成原子和分子键的水平上破译其 3D 结构。研究人员经常研究 DNA 和蛋白质分子，方法是将它们变成规则堆积的晶体，可以用 X 射线束(X 射线晶体学)或无线电波(核磁共振)检查。然而，这些技术不能以几乎相同的效率应用于 RNA 分子，因为它们的分子组成和结构灵活性阻止它们容易形成晶体。
现在，由 Wyss Core 教员 Peng Yin 博士领导的一项研究合作。在哈佛大学 Wyss 仿生工程研究所和 Maufu Liao 博士。在哈佛医学院 (HMS)，报告了一种全新的 RNA 分子结构研究方法。ROCK，顾名思义，使用 RNA 纳米技术，可以将多个相同的 RNA 分子组装成高度有序的结构，从而显着降低单个 RNA 分子的灵活性并使其分子量成倍增加。研究小组将具有不同大小和功能的著名模型 RNA 用作基准，表明他们的方法能够使用称为冷冻电子显微镜的技术对所含 RNA 亚基进行结构分析(冷冻电镜)。他们的进展发表在Nature Methods中。
“ROCK 正在打破目前 RNA 结构研究的限制，并能够以近原子分辨率解锁现有方法难以或不可能访问的 RNA 分子的 3D 结构，”Yin 说，他与 Liao 一起领导了这项研究. “我们预计这一进展将振兴基础研究和药物开发的许多领域，包括新兴的 RNA 治疗领域。” Yin 还是 Wyss 研究所分子机器人计划的负责人，也是 HMS 系统生物学系的教授。
获得对 RNA 的控制
威斯研究所的尹教授团队开创了各种方法，使 DNA 和 RNA 分子能够根据不同的原理和要求自组装成大型结构，包括 DNA 砖和 DNA 折纸。他们假设这种策略也可用于将天然存在的 RNA 分子组装成高度有序的环状复合物，通过将它们特异性连接在一起，它们的弯曲和移动自由度受到高度限制。许多 RNA 以复杂但可预测的方式折叠，小片段彼此碱基配对。结果通常是稳定的“核心”和“茎环”向外围凸出。
“在我们的方法中，我们安装了‘接吻环’，将属于相同 RNA 的两个拷贝的不同外周茎环连接起来，从而形成一个整体稳定的环，包含多个感兴趣的 RNA 拷贝，”Di 说刘博士，两位第一作者之一，尹氏课题组博士后。“我们推测这些高阶环可以通过cryo-EM进行高分辨率分析，该技术已首次成功应用于RNA分子。”
描绘稳定的 RNA
在低温 EM 中，许多单个粒子在低温下被快速冷冻以防止任何进一步的运动，然后通过电子显微镜和计算算法的帮助进行可视化，这些算法比较粒子的 2D 表面投影的各个方面并重建其 3D 结构. Peng 和 Liu 与 Liao 和他的前研究生 François Thélot 博士合作，后者是该研究的另一位共同第一作者。Liao 和他的团队为快速发展的低温电磁场以及特定蛋白质形成的单个粒子的实验和计算分析做出了重要贡献。
“与传统方法相比，Cryo-EM 在查看包括蛋白质、DNA 和 RNA 在内的生物分子的高分辨率细节方面具有很大优势，但大多数 RNA 的小尺寸和移动趋势阻碍了 RNA 结构的成功确定。我们组装 RNA 多聚体的新方法通过增加 RNA 的大小并减少其运动，同时解决了这两个问题，”同时也是 HMS 细胞生物学副教授的廖说。“我们的方法为通过冷冻电镜快速测定许多 RNA 的结构打开了大门。” RNA纳米技术和cryo-EM方法的整合使该团队将他们的方法命名为“通过安装接吻环实现RNA寡聚化的cryo-EM”(ROCK)。
为了为 ROCK 提供原理验证，该团队专注于来自单细胞生物四膜虫的大内含子 RNA 和来自固氮细菌 Azoarcus 的小内含子 RNA，以及所谓的 FMN 核糖开关. 内含子 RNA 是散布在新转录的 RNA 序列中的非编码 RNA 序列，必须“剪接”出来才能生成成熟的 RNA。FMN 核糖开关存在于与维生素 B2 衍生的黄素代谢物生物合成有关的细菌 RNA 中。在结合其中一种黄素单核苷酸 (FMN) 后，它会转换其 3D 构象并抑制其母 RNA 的合成。
“将四膜虫 I 组内含子组装成环状结构使样品更加均匀，并能够利用组装结构的对称性使用计算工具。虽然我们的数据集规模相对适中，但 ROCK 的先天优势使我们能够以前所未有的分辨率解决结构问题，”Thélot 说。“RNA 的核心分辨率为 2.85 Å [1 Ångström 是一百亿 (US) 一米，是结构生物学家使用的首选度量标准]，揭示了核苷酸碱基和糖骨架的详细特征。我不认为我们没有 ROCK 就可以到达那里——或者至少在没有更多资源的情况下不会。”
Cryo-EM 还能够捕获处于不同状态的分子，例如，如果它们改变其 3D 构象作为其功能的一部分。将 ROCK 应用于 Azoarcus 内含子 RNA 和 FMN 核糖开关，该团队设法识别了 Azoarcus 内含子在其自剪接过程中转变的不同构象，并揭示了 FMN 核糖开关配体结合位点的相对构象刚性.
“彭寅和他的合作者的这项研究优雅地展示了 RNA 纳米技术如何作为促进其他学科发展的加速器。能够可视化和理解许多天然存在的 RNA 分子的结构可能会对我们对许多生物学和病理学的理解产生巨大影响跨不同细胞类型、组织和生物体的过程，甚至可以实现新的药物开发方法，”Wyss 创始董事 Donald Ingber 医学博士说。
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