一种用于真菌基因编辑的方法

CRISPR / Cas9现在是与基因工程研究相关的家喻户晓的名称。通过在科学报告中发表的论文中描述的尖端研究，

由Takayuki Arazoe博士和Shigeru Kuwata教授领导的东京理科大学，明治大学和东京农业技术大学的研究小组最近建立了一系列提高靶向基因破坏效率的新策略和使用CRISPR / Cas9系统在稻瘟病真菌Pyricularia(Magnaporthe)oryzae中的新基因“引入”。这些策略包括更快(单步)基因导入，使用小同源序列，以及绕过某些先决条件宿主DNA“模式”和宿主组分修饰。

通过Arazoe博士和桑田教授领导的研究小组已经设计使用CRISPR用于基因编辑(目标基因破坏序列的取代，并重新引入所需基因的)简单且快速的技术/ Cas9在稻瘟病菌稻瘟病(稻瘟病)米曲霉，一丝状真菌的类型。受到令人鼓舞的结果的推动，研究人员推测，“植物及其病原体仍在自然界中共同发育。利用模式致病真菌的突变机制作为基因组编辑技术可能会导致基因工程中进一步新技术的发展。”

CRISPR / Cas9系统的工作组分与靶基因区域(DNA)结合并在DNA中引起位点特异性双链断裂(DSB)。该组分的有效结合需要一定的“基序”或“模式”，称为原型间隔区 - 邻接基序(PAM)，其位于靶基因区域的下游。

大多数基因组编辑技术需要在靶位点诱导的DSB，其触发宿主中的DNA“修复”途径。同源重组(HR)是修复DSB的机制，它是有用的，因为它增加了互补序列。然而，基础方法是费力的，其效率通常取决于外部因素，例如主机属性以及PAM。HR可分为两种途径：“非交叉”(基因转换)和“交叉”型。已知交叉型修复发生在经历减数分裂的细胞中。然而，对它们在有丝分裂细胞中的作用的理解是有限的，并且关于丝状真菌的这种信息实际上是不可获得的。研究人员正在寻求解决这方面的知识差距。

在他们的研究中，研究人员首先创建了一种基于CRISPR / Cas9的载体(基因传递系统)，以确认稻瘟病真菌中受体基因区域的交叉型HR。

然后，为了检查基因靶向或“序列替换”，他们创建了一种“突变”载体，针对单交换型HR进行了优化，用于靶向破坏编码scytalone脱水酶(SDH)的宿主基因，SDH是一种参与黑色素形成的蛋白质。将该载体导入含有潮霉素B磷酸转移酶(hph)基因的载体中，该载体赋予对抗生素潮霉素B的抗性。研究人员推测单交换型HR将整个载体与hph一起插入靶位点。具有破坏的SDH基因的突变体将在含有潮霉素B的培养基上被鉴定为白色菌落(由于黑色素的丧失)。研究人员发现使用CRISPR / Cas9载体显着增加了潮霉素B抗性白色菌落的数量，这意味着CRISPR / Cas9系统可有效诱导单交换型HR。这项技术的最大好处是它需要极短的同源序列(100个碱基对;这在分子生物学中确实很小)。

研究人员还使用类似的策略来检查基因引入(或“敲入”)是否可能通过单交换型HR使用CRISPR / Cas9载体。他们使用绿色荧光蛋白(GFP)基因，该基因被广泛用作“报告基因”，使宿主细胞在插入基因组时发出荧光绿光。他们推测单交换HR会导致GFP进入受体序列。实际上，他们发现使用CRISPR / Cas9载体在潮霉素培养基上产生绿色荧光菌落。这些发现表明CRISPR / Cas9系统可用于有效的“一步”基因敲入。

这项研究指出了一个令人惊讶的事实，也许PAM并不是真菌中CRISPR / Cas9基因编辑所必需的。该研究小组表示，“我们发现丝状真菌具有独特的基因组特征，即使在体细胞中，通过切割靶DNA也可以诱导交叉。我们利用这些特征来破坏靶DNA，引入“报告基因”。我们还成功地通过一步法提高了敲入效率和速度。这项技术克服了PAM的限制 - 这是CRISPR /的最大缺点之一Cas9系统 - 并且能够进行更灵活的基因组编辑，这在以前的丝状真菌研究中一直很困难。“

最后，当被问及这项研究的更广泛应用时，Arazoe博士和Kuwata教授雄辩地说：“稻瘟病真菌是导致水稻破坏性疾病的重要病原体，水稻是该国的主食。基于CRISPR / Cas9的在我们的研究中开发的基因组编辑技术可以加速对这种病原体的分子生物学研究，最终有助于稳定的食物供应和基于植物的食品安全。此外，该技术适用于工业中广泛使用的其他丝状真菌 - 特别是在生物加工中，食品和发酵工业。“

标签：真菌基因编辑