DNA碱基编辑诱导大量的脱靶RNA突变

在发表的一项研究中自然6月10日，由杨晖博士的实验室在中国的院士(CAS)的神经科学研究所，和合作者从CAS-MPG合作伙伴研究所计算生物学和四川大学的研究人员证明DNA碱基编辑器产生了数以万计的脱靶RNA单核苷酸变体(SNV)，这些脱靶SNV可以通过向脱氨酶引入点突变来消除。

该研究揭示了DNA基础编辑风险的先前被忽视的方面，并通过设计脱氨酶进一步提供了解决该问题的方法。

DNA碱基编辑方法已经能够在基因组DNA中进行直接点突变校正，而不会产生任何双链断裂(DSB)，但潜在的脱靶效应限制了这些方法的应用。腺相关病毒(AAV)是DNA编辑基因疗法最常用的传递系统。由于这些病毒可在体内维持长期基因表达，因此DNA碱基编辑诱导的潜在RNA脱靶效应的程度对其临床应用非常关注。

以前的几项研究已经通过DNA碱基编辑评估了基因组DNA中的脱靶突变。同时，常用DNA碱基编辑器所必需的脱氨酶通常表现出RNA结合活性。例如，发现胞嘧啶碱基编辑器(CBE)中使用的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1靶向DNA和RNA，并且发现腺嘌呤碱基编辑器(ABE)中使用的腺嘌呤脱氨酶TadA诱导RNA上的位点特异性肌苷形成。然而，尚未评估由DNA碱基编辑引起的任何潜在的RNA突变。

为了评估DNA碱基编辑在RNA水平上的脱靶效应，研究人员计算了CBE或ABE处理细胞的每个重复中的脱靶RNA SNV，然后探讨了消除这些细胞的可能性。通过设计DNA碱基编辑器的脱氨酶来靶RNA SNV。

他们将一种类型的CBE，BE3(APOBEC1-nCas9-UGI)或ABE，ABE7.10(TadA-TadA * -nCas9)与GFP和有或没有单指导RNA(sgRNA)一起转染到HEK293T培养物中。细胞。在这些HEK293T细胞中通过BE3和ABE7.10验证DNA编辑的高靶上效率后，他们在这些样品上以125X的平均深度进行RNA-seq，并定量评估每个重复中的RNA SNV。

在CBE或ABE处理的细胞的每个重复中评估靶上编辑效率以保证有效编辑。然后将CBE和ABE处理组中脱靶RNA SNV的数量与仅GFP对照组进行比较。他们在DNA碱基编辑处理的细胞中发现了显着更高数量的RNA SNV。

此外，研究人员发现，BE3-或ABE7.10处理的细胞中的突变偏差分别与APOBEC1或TadA的突变偏差相同，表明脱靶效应是由DNA碱基编辑的过表达引起的。他们还鉴定了这些脱靶RNA SNV的CBE和ABE特异性基序和遗传区域。

为了消除碱基编辑的RNA脱靶活性，他们检查了在APOBEC1或TadA上引入点突变的效果。三种高保真变体BE3W90Y + R126E，BE3(hA3AR128A)和BE3(hA3AY130F)将RNA脱靶SNV降低至基础水平。类似地，ABE变体ABE7.10F148A也显示完全消除脱靶效应。

该研究通过向脱氨酶引入点突变获得了CBE和ABE的高保真变体，并提供了使用合理工程提高基础编辑特异性的方法。

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