了解藻类和真菌的昼夜节律

真菌，藻类和蓝细菌可能不会抱怨时差。但与人类一样，在缺乏外部线索的情况下，他们的生理学坚持大约24小时的行为模式。经历反复日夜循环的生物体已经进化出生化振荡器或生物钟。该时钟确定从睡眠到细胞代谢的哪些活动在生物学上有利的时间发生。

由于几乎所有生物都具有昼夜节律，因此生物学家在实验室中有大量遗传易处理的机会。研究集中在转录基因的变化如何在24小时循环中导致不同蛋白质的表达。由生物钟指示的周期性或“节律性”表达允许生物通过优化在任何给定时间存在的蛋白质的补体来预测规则的环境变化。

EMSL，环境分子科学实验室，位于华盛顿州里奇兰的太平洋西北国家实验室(PNNL)的DOE科学办公室用户设施提供的独特功能，为生物学家提供了以前所未有的细节研究蛋白质和代谢途径如何变化的机会一天的过程。美国能源部生物与环境研究办公室(BER)对改善生物燃料植物和真菌的稳健性和恢复力的兴趣促使最近几项对昼夜节律驱动因素的调查。

从蓝细菌到昼夜节律

EMSL参与昼夜节律研究的起源于EMSL的大挑战计划。2005年，圣路易斯华盛顿大学生物学教授Himadri Pakrasi与PNNL首席技术官David Koppenaal一起工作，他们利用该计划提供的资源开始开发蓝藻系统级模型。Pakrasi在2010年回应了EMSL的提案征集，该活动促成了合成生物学研究活动和一系列关于如何优化光合微生物进行遗传生物量生产的出版物。

Pakrasi说：“蓝藻是唯一可以确定的具有昼夜节律的原核生物，就像我们一样。”

产生氧气的光合微生物是全球碳和氮循环的主要贡献者，并且通过生物钟控制细胞生理学实现日常节律允许这些生物体适应环境变化，包括光和温度。Pakrasi指出，虽然研究蓝藻的研究人员长期观察有节奏的日常过程，但研究界认为这些生物“缺乏生物钟所必需的复杂性”。然而，观察细胞功能(例如固氮)中的振荡已经证明蓝细菌满足昼夜节律振荡器的标准。

Pakrasi及其同事继续他们的工作，以了解如何控制蓝细菌的日常过程，包括调节快速细胞生长，光捕获和细胞氧化还原控制的机制。他们的工作利用比较蛋白质组学，比较生物体表达的整个蛋白质补体的变化。此类测量需要EMSL的专业仪器和技能组合。

“蛋白质组学和代谢组学测量是许多机构无法做到的两组数据，”PNNL系统生物学家William Cannon说。

不只是基因

伦斯勒理工学院的生物学家Jennifer Hurley和达特茅斯Geisel医学院的Jay Dunlap从用户设施的首席生物学家Scott Baker那里了解到EMSL的蛋白质组学能力。他们提交了一份调查真菌蛋白质组的提案，其生物钟与人类一样。

在所有活细胞中，DNA被转录成细胞核中的RNA。转录的RNA-转录组 - 从细胞核进入细胞质，在细胞质中转化为蛋白质。对昼夜节律的最简单解释是，如果每天一次转录的RNA比另一个时间更多，那么在一天的某些时间应该有更多的某些蛋白质。但这并非总是如此。

“我们开始了解到，我们不能相信我们在转录组中看到的可靠地预测蛋白质组，”Hurley说。

研究人员向EMSL发送了一种名为Neurospora crassa的样品，这是一种因生产生物纤维而生产纤维素的生物。在那里，Erika Zink和Sam Purvine打开细胞，提取蛋白质，并使用先进的质谱技术分析样品。

“我们正在寻找蛋白质对的相对数量，并寻找随时间变化的一般趋势，”Purvine说。

对于昼夜节律，这意味着在48小时内每两小时跟踪从生长室中拉出的细胞中哪些蛋白质水平显着变化。

Hurley和Dunlap在蛋白质组学数据中发现了令人惊讶的模式。在脉孢菌(Neurospora)生命中24小时内上升和下降的蛋白质中，只有60%对应于转录组的变化。尽管相应的RNA没有振荡，但其余的蛋白质仍然不同。

“如果你只看转录组，那么你所知道的蛋白质组中有40%是有节奏的，”邓拉普说。

研究人员对蛋白质组和转录组缺乏对应关系的第一个假设是蛋白质降解遵循昼夜节律。相反，他们找到了翻译率的答案。

“在一天的某个时间，细胞使RNA蛋白质比其他时间更快，”Dunlap说。

这些蛋白质的时间导致不同代谢途径的协调，这对细胞的整体功能至关重要。

这项工作突出了研究蛋白质组的必要性，以了解生物钟如何调节机体的代谢产物。未来的研究将调查代谢反馈如何改变昼夜节律调节;在很长的时间内，生物钟是否是对新陈代谢的进化适应。

意想不到的途径

像脉孢菌一样，单细胞绿藻Chlamydomonas reinhardtiis具有创造生物燃料的潜力。加利福尼亚大学洛杉矶分校(UCLA)的生物化学家Sabeeha Merchant研究了生物体的分子生物学如何响应光明和黑暗周期;具体而言，细胞如何决定何时分成两部分。她曾与EMSL工作人员合作过其他几份出版物，并寻求用户设施的专业知识来了解衣藻的蛋白质组。

商人和加州大学洛杉矶分校项目科学家Daniela Strenkert在12小时光暗周期中培养衣藻，以建立细胞的同步培养。该循环确保每24小时分割数百万个细胞。实验系统允许研究人员观察细胞分裂过程中事件和途径的连续顺序，扩增数百万次。

商人，Strenkert和他们的团队在昼夜循环过程中每两小时从细胞中提取RNA，这是由地球每日旋转引起的24小时光照/黑暗循环，并确定了转录组。

“当你看到RNA时，你不知道是否存在任何蛋白质，”Merchant说。“你需要通过观察蛋白质组来验证它。”

利用Purvine和Mary Lipton在EMSL提供的蛋白质组学数据，Merchant分析了转录组与色素，代谢物和生理变化的测量结果的比较。研究人员发现，85%的衣藻基因组在一天中表达不同，以协调细胞分裂前的细胞生长。基因变化的时间取决于它们的生物学功能;例如，促进叶绿体中转录的西格玛因子在光线持续之前在黑暗中增加。

代谢途径也遵循昼夜循环。正如所预期的任何光合细胞一样，衣藻在白天以葡萄糖或淀粉的形式储存碳，并在晚上将淀粉破碎以产生丙酮酸。研究人员预计，细胞会通过与呼吸相结合的完全氧化从丙酮酸中提取更多能量。在呼吸过程中，丙酮酸氧化过程中产生的辅因子分子(NADH)通过氧气再生，使生物体能够提取更多的能量。

但令研究人员惊讶的是，衣藻在黑暗中没有参与呼吸。相反，细胞在没有氧的情况下具有代谢丙酮酸的另一种选择。在发酵过程中，生物体通过转化为乳酸来代谢丙酮酸。

“当我们的氧气耗尽时，这就是我们肌肉发生的过程，”Merchant说。“我们认为给他们足够的氧气意味着他们总会使用呼吸。”

即使氧气充足，藻类也会进行发酵。

该小组提出了对这条令人惊讶的途径的可能解释：在黑暗中细胞可能不需要太多能量，速度可能优先于能量产生。通过发酵的丙酮酸代谢可能比与呼吸相结合的丙酮酸代谢更快。或者，藻类可以故意选择发酵，以便它们可以为其环境中的其他微生物提供发酵产物，作为合作相互作用的形式。

来自这些项目的详细蛋白质组和转录组数据集将是一种宝贵的资源，因为研究界探讨了昼夜节律钟如何导致对细胞整体功能至关重要的不同代谢途径的协调。

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