最近开发的一种称为光片荧光显微镜的技术通过允许研究人员使用荧光标签创建组织的三维图像，甚至是活体动物胚胎，已经产生了许多生物学发现。现在，研究人员报告了使用称为三光子吸收的光学现象来增加光片荧光显微镜成像深度的能力。
在光学学会(OSA)期刊“光学快报”中，研究人员详细报道了三光子吸收如何与光片荧光显微镜一起使用以更深入地成像到组织中。作为演示，他们使用组合技术在整个培养细胞球(称为球状体)中产生清晰的图像，直径约450微米。
“这次演示非常重要，因为它解决了深度更好成像的未满足需求，这可以帮助科学家获得更好的生物过程数据，”研究小组负责人，英国圣安德鲁斯大学的Kishan Dholakia表示，“这种方法可以对于神经科学和发育生物学研究特别有用，可能会用于以药物发现的自动化方式对多个样本进行成像。“
对荧光标记成像所需的光可能对精细的生物样本(例如用于研究发育和疾病过程的脑组织或动物胚胎)具有破坏性甚至致命性。光片荧光显微镜可以实现快速，高分辨率的成像，几乎没有光学损伤，因为它只用一薄薄的光照射样品;样品的其他部分不会受到任何不必要的光照。
“我们期望三光子光片荧光显微镜能够对啮齿类动物(如小鼠和大鼠)的大脑成像产生巨大影响，它可用于捕获具有亚细胞分辨率的非常宽视野图像，”该论文的第一作者说。 AdriàEscobet-Montalbán。
更深入的成像
研究人员希望将三光子光片荧光显微镜与之前使用的双光子吸收进行比较。在多光子吸收中，荧光标记在吸收或被两个或三个光子激发后发出光，而不是用于产生传统荧光的一个光子。
多光子吸收减少了失焦光，并最大限度地减少了可能损害样品的光线，因为它使用较长的波长，通过组织散射较少，并将激发光限制在较小的体积内。当三个光子用于产生荧光而不是两个时，这些益处被放大。
为了展示他们的新技术，研究人员使用标准光学装置进行光片荧光显微镜检查，脉冲激光传统上用于双光子激发。虽然这种激光不是最适合创建有效的三光子激发，但它是比较双光子和三光子激发的理想选择。
研究小组使用双光子和三光子激发成像人胚胎肾细胞的球状体。在球体表面附近，两种成像方式表现相似。然而，在球体的远侧，三光子光片荧光显微镜的图像质量保持了图像对比度，而双光子图像的质量显着下降。
优化技术
为了进一步改善深度成像和视野，研究人员尝试将激光的光强度曲线改变为贝塞尔光束，贝塞尔光束具有由同心环包围的中心亮核，而不是传统的高斯激光束，如同激光笔。
“Bessel光束可以用于双光子光片模式，但由于它们的同心环可能会产生潜在的伪影，”共同作者Federico Gasparoli说。“这是我们第一次在数值和实验上显示这些问题在三光子光片荧光显微镜中被抑制，并且光束变得更深，这使得这种方法非常有吸引力。”
接下来，研究人员计划通过使用专门设计用于三光子吸收的更长波长的激光系统来改进该技术。这应该能够增加深度成像。与此同时，研究人员正致力于研究检测样品内部荧光标记发出的光的方法。
标签： 生物医学显微镜技术
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