解说代谢物酶促终点法测定酶的浓度结果是什么

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在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐减少，产物逐渐增多，一定时间后待测物全部转化为产物，反应趋于平衡。

测定反应完全后(反应达到平衡时)待测物或产物变化的总量，即终点法，又称平衡法。

代谢物浓度酶促终点法测定的基本条件是：

①待测物浓度[S]应远小于其米氏常数Km，此时任何时刻的反应速度ν=V[S]/Km，呈一级反应动力学;

②反应配方中所用酶量应足够大，而Km应小，以保证有较快的反应速度完成测定。

(1)一步法

如果待测物与产物在理化性质上有便于检测的差异，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析，这种是最简单的底物法测定。

(2)酶促偶联法

如果酶促反应的底物或产物没有可直接检测的成分，则可将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，而达到检测的目的。

一般把第一步反应称为辅助反应，所用工具酶叫辅助酶，偶联的反应称为指示反应，指示反应所用的工具酶叫指示酶。

偶联反应应设计为非限速反应。

(3)最常用的偶联指示系统有两个

以脱氢酶为指示系统的酶促反应，不管是终点法测定，还是动力学法测定，共同的缺陷是受到内源性脱氢酶及其底物如乳酸脱氢酶和乳酸/丙酮酸的干扰。

为了消除乳酸脱氢酶的干扰，在反应设计时一般采用加入乳酸脱氢酶的抑制剂的方法来解决。

终点法还受到乳糜、黄疸和溶血的影响，测定时需设定样品空白。

终点法实验设计应考虑的问题

①所用工具酶的特异性。

②酶对待测物的亲和力，在保证测定线性的前提下，Km要尽量小。

③酶的用量要足够大。

④工具酶中的杂酶应低于允许限。

⑤反应平衡点：应创造条件使反应朝正反应方向进行。

⑥试剂中的附加剂(如稳定剂、防腐剂、赋形剂)，不应抑制酶的活性。

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