STED显微镜中的光漂白克服了

光学显微镜是我们在三维空间内观察活细胞或活组织的唯一方式。电子显微镜仅给出二维视图，并且由于电子束的极热，有机样品会快速燃烧，因此不能活着观察。此外，通过使用专门设计的荧光分子标记我们感兴趣的结构的生物分子，我们可以将其与周围环境区分开来：这是荧光显微镜。

直到20世纪90年代中期，荧光显微镜受到基本物理学的阻碍：由于衍射极限，样品上的任何特征比约250纳米更靠近在一起会模糊。病毒和单个蛋白质比这小得多，因此无法以这种方式进行研究。但是在1994年左右，在教导我们在应用基本物理原理时必须注意的一个很好的教训中，Stefan Hell发现了受激发射耗尽(STED)显微镜，它现在是几种实现“超分辨率”的光学显微镜方法之一，超出衍射极限的分辨率。他与Eric Betzig和William Moerner一起于2014年获得了“超分辨荧光显微镜”的诺贝尔化学奖。

为了解衍射极限为什么是一个问题，想象一下感兴趣的结构非常小，比如50纳米，像病毒一样，并且已经用荧光生物分子标记。现在想象一下用激光光斑照射它，比如直径为200纳米。被照射的标记分子在随机时间通过荧光自发地发光，其概率随时间迅速下降。来自许多荧光分子的光子使用透镜聚焦到探测器上，形成单个无特征像素。它并不完全明亮，因为照明圆中只有一小部分样品含有荧光分子。如果你要将激光器向任何方向移动200纳米，在这个例子中，没有荧光分子存在，信号肯定会变暗。所以，这个相当暗淡的像素告诉我们在这个200纳米直径的样品区域内存在某些东西。如果我们使用基本方法，衍射极限可以防止我们从较小区域形成像素。

STED显微镜的物理概念非常简单。随着激光光斑再次照亮小荧光结构周围的区域，假设您以某种方式阻止光从点内尽可能大的区域发送到探测器 - 留下一个更小的点，例如直径为60纳米。现在，如果您将激光器在任何方向上移动60纳米并且信号变暗，则图像中的像素表示存在高达60纳米的结构。衍射极限已被打败。当然，一个这样的像素是无特征的，但是可以通过扫描并记录许多不同亮度的像素来建立线粒体的清晰图像。(参见图1.“时间选通STED显微镜”用于捕获本文中的大部分图像。)

Stefan Hell获得诺贝尔奖的发现包括两个见解。首先，他想到了在大小与衍射极限相匹配的照明点内尽可能大的区域阻止光被发送到探测器的想法。其次，他想出了如何实现它。

两个激光照亮同一个地方。第一个激光激发标记分子电子，它们自发地衰变回基态，每个激发一个特定波长的可见光子。(这是荧光。)该过程是随机的，发射概率随时间相当快地减小，这意味着大多数光子在被照射的样品的前几纳秒内发射。第二个激光器，“STED光束”，在中间形成一个孔，以便不影响那里的标记分子，被调谐以刺激外环中受激发的标记分子发射光子。但这些光子与中间发射的光子有何区别?

来自外环的发射过程也是随机的，但发生得更快，概率迅速下降，这意味着大多数这些光子在纳秒左右发射。当两个叠加的光束扫过样品时，当环的中心发出荧光时，周围的分子已经通过发射光子而被迫进入基态 - 它们已被“关闭”。STED显微镜技术以这种方式依赖于巧妙的计时。原则上，发光中心点的大小可以根据需要制作，因此任何分辨率都是可能的。然而，环形“STED光束”将以集中的可见激光的形式将能量传递到活细胞的更大区域，从而有可能将其杀死。

然而，这个过程并不理想，并且由此产生的图像会失去一些清晰度，因为外环中的某些标记分子没有被正确关闭 - 毕竟这个过程是概率性的 - 当它们发荧光时它们会污染来自中心的信号。然而，由于自发和受激发射的不同时间，到达探测器的最早光子来自最高STED光束强度照射的区域，最后到达的光子很可能来自位于中心点的标记分子。 。因此，通过在记录图像之前等待一小段时间(大约一纳秒)，可以滤除来自外环的大部分光子。这被称为“时间门控STED显微镜”。通过称为反卷积的过程实现图像的进一步锐化。

超分辨率显微镜的发明预示着生命科学的飞跃。可以以前所未有的分辨率观察到生物体。然而，图像的延时序列不能在任何适当的时间长度上进行，因为标记分子在强烈的STED光束下会降解并停止发荧光。这是光漂白问题。受损的标记分子也可能对细胞有毒。

光漂白问题解决了

名古屋大学转化生物分子研究所(ITbM)的Shigehiro Yamaguchi和Masayasu Taki领导了一个研究小组，该研究小组开发了一种标记分子，称为“MitoPB黄”，被线粒体的内膜吸收，包括嵴 - 折叠状结构 - 并且在STED梁下具有长寿命。针对线粒体的标记分子的想法来自ITbM的共同作者Chenguang Wang。使用单个STED激光器的多色STED成像也是可能的;研究人员预计，类似于MitoPB Yellow的荧光标记物应该在其他超分辨率技术中找到广泛的应用(例如Eric Betzig和William Moerner开发的那些)。

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